制服丝袜 相似使用ICG作念手术导航，这种要领肿瘤识别精确率高达97%

发布日期：2024-10-04 20:53    点击次数：91

相似使用ICG作念手术导航，这种要领肿瘤识别精确率高达97%

Pal， R.; Lwin， T. M.; Krishnamoorthy， M.; Collins， H. R.; Chan， C. D.; Prilutskiy， A.; Nasrallah制服丝袜， M. P.; Dijkhuis， T. H.; Shukla， S.; Kendall， A. L.; Marshall， M. S.; Carp， S. A.; Hung， Y. P.; Shih， A. R.; Martinez-Lage， M.; Zukerberg， L.; Sadow， P. M.; Faquin， W. C.; Nahed， B. V.; Feng， A. L.; Emerick， K. S.; Mieog， J. S. D.; Vahrmeijer， A. L.; Rajasekaran， K.; Lee， J. Y. K.; Rankin， K. S.; Lozano-Calderon， S.; Varvares， M. A.; Tanabe， K. K.; Kumar， A. T. N. Fluorescence Lifetime of Injected Indocyanine Green as a Universal Marker of Solid Tumours in Patients.

Nat. Biomed. Eng 2023.

https://doi.org/10.1038/s41551-023-01105-2.

Introduction

序文

在昔日二十年里，术中肿瘤识别的分子靶向荧光示踪剂和成像系统取得了显耀阐述。现在已确立出针对肿瘤特异性分子抒发、酶活性或肿瘤微环境额外生理情景的荧光探针，何况一些探针已插足后期临床训练，致使最近，FDA最近批准了5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和帕呋拉西宁（OTL38）动作首批术中肿瘤显像剂。5-ALA可产生脑肿瘤可见荧光，而OTL38则是一种近红外叶酸受体α靶向荧光团。固然好意思国FDA批准的近红外染料吲哚菁绿（ICG）并非专为肿瘤瞎想，但在癌症图像指引手术中得到了世俗应用。岂论领受哪种靶向机制，肿瘤对荧光探针的经受情况齐存在异质性，导致聪惠度低、假阳性率高。现存的成像剂在东谈主类多种癌症类型的细胞特异性上尚未得到证实。限度现存探针性能的一个进击因素是它们与基于荧光强度的成像手艺齐集使用，而荧光强度取决于肿瘤的大小和深度、染料招揽、探伤器成果、照明功率、与盘算推算的距离以过火他与系统联系的参数，因此，很难对不同成像系统和患者的肿瘤特异性对比度进行完满量化，这可能会断绝荧光成像在临床上的世俗应用和手术指引的圭臬化。

 

Results闭幕

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Liver cancer肝癌

征询东谈主员对原发性和调整性肝肿瘤手术患者进行的实验，征询发现，在肝细胞癌（HCC）中，肿瘤内的荧光强度不均匀，存在亮区和暗区（图 1a），何况与泛泛组织的荧光有重迭（图 1b）。此外，肿瘤内的荧光寿命（荧光寿命）明显长于周围泛泛肝骨子（图 1a 右）。此外，关于分化较差的调整性结直肠癌，荧光强度沿肿瘤范畴较高，标明染料在肿瘤周围积存（图 1e），这种惬心是由于 ICG 在肿瘤周围的肝细胞和纤维组织中积存所致，而荧光寿命则露出，与泛泛肝比较（0.54 ± 0.01 ns），肿瘤内的荧光寿命（图 1d 右和图 1f）要长得多（0.62 ± 0.002 ns）。为了说明这种惬心源自于肿瘤里面的ICG而非组织自愿荧光，作家测定了8名为打针ICG的患者的肝脏肿瘤，闭幕标明其之前测定的长荧光寿命如实是来自肿瘤中的 ICG，而细胞层面的荧光寿命成像（FLIM）（图 1g 右和图 1i）也进一步说明了肿瘤中荧光寿命比泛泛组织的要长。此外，运用组织学界说的肿瘤和泛泛肝骨子进行肿瘤/泛泛分类的接收器操作特征（ROC）分析运用组织学界说的肿瘤和泛泛肝骨子进行肿瘤/泛泛分类的接收器操作特征（ROC）分析露出（图 1k 和图 1m ），基于FLM肿瘤识别的准确率（弧线底下积，AUC）为 98%，聪惠度为 94.3%（95% 置信区间 (CI) 92-96%）和特异性 95%（95% 置信区间 (CI) 92.7-96.6%）；而对应的基于荧光强度（J = 13.9%）的准确性为 55%，聪惠度为 57.3%（95% 置信区间 (CI) 53.1-61.4%）和特异性为 49.8%（95% 置信区间 (CI) 45.3-54.2%）。除了在麻省总病院（MGH）进行的临床征询外，作家还回首性地检查了莱顿大学之前进行的 ICG 临床训练的 mCRC 患者标本（n = 3），并发现肿瘤荧光寿命明显加多，固然还需要进一步征询细目肝脏肿瘤最好分类性能的剂量和打针期间，但这些数据补助肝脏肿瘤中荧光寿命增强的细胞源流，以及使用荧光寿命比荧光强度更高的肿瘤与泛泛分类性能准确性。

图1. a）患者刚切除的 HCC 标本的像片、荧光强度和荧光寿命图，b，c） Violin 图露出了肿瘤和泛泛肝各像素的强度（b）和 荧光寿命（c）分散。虚线暗示临床细见识肿瘤范畴。e，f）露出了 d 所示标本中肿瘤和泛泛肝像素的强度（e）和 荧光寿命（f）分散。h、i）Violin 图露出了 g 中所示标本中经组织学证实的肿瘤范畴（g 中的黄线）、发炎的基质和泛泛肝细胞区域内各像素的强度（h）和 荧光寿命（i）分散情况。j）g 中泛泛组织和 HCC 组织区域的高分辨率（20 倍放大率）组织学图像（左列）、荧光强度图像（中列）和荧光寿命图像（右列）。k，l）g 中组织学界说的肿瘤范畴内（红色）和范畴外（绿色）的荧光强度（k）和 荧光寿命（l）直方图。m）g 中标本中肿瘤与泛泛组织分类的 ROC 弧线，基于 荧光寿命（红色）和强度（绿色）分类的准确率（AUC）分别为 98% 和 55%。灰色暗影区域代表 95% 的置信区间。n）肿瘤细胞（玄色）和泛泛肝细胞（灰色）的代表性 TD 荧光衰减弧线。

 

Head and neck cancer

头颈部癌症

在8例头颈部（HN）癌症患者的口腔鳞状细胞癌（OSCC）标本中，有7例露出肿瘤中的荧光寿命比较泛泛组织更长，只消一个额外的纺锤形细胞癌患者例外。荧光图像露出长荧光寿命局限于肿瘤范畴内，而无肿瘤组织的荧光强度和荧光寿命相对较低。由于无法得到包含肿瘤和泛泛组织的全侧切片，对HN标本的宽视线图像未能进行组织学考据，因此，征询东谈主员将再行鲜标本切下的组织横截面（约10微米）的FLIM与疏通切片的组织学进行了比较，以考据荧光寿命增强的显微特异性。在FLIM图像中，不雅察到了荧光寿命较长的区域与组织学图像上浸润肿瘤细胞的显微巢之间近乎。

多名HN癌患者的共聚焦显微镜数据标明，泛泛组织中有多数ICG保留，肌肉、血管、泛泛基质的荧光强度与肿瘤、发育不良和肿瘤浸润淋巴细胞卓著。关联词，在统统患者中，肿瘤、发育不良上皮细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的荧光寿命比几种泛泛组织类型要长得多。ROC分析露出，使用荧光寿命对肿瘤与泛泛组织分类的准确率为98%，而使用强度进行分类的准确率为63.3%，比较之下，基于强度的分类的准确度、聪惠度和特异度明显低于基于荧光寿命的分类。

此外，对使用较高ICG剂量（5 mg/kg）的HN手术患者标本进行了评估，闭幕露出肿瘤荧光寿命仍然明显加多，但泛泛组织荧光寿命也相应升高，这可能与高剂量ICG未完全吊销筹办。

图2. a-c）SCC患者的彩色像片（左）、宽场荧光强度（中）和荧光寿命图（右），他们分别患有左耳皮肤 SCC（a）、舌头口腔 SCC（b）和组织学上无肿瘤的舌头标本（c）。d，e）左下颌 OSCC 标本（d）和舌 OSCC 标本（e）的组织学、显微荧光强度和 FLIM。f）在舌部的 OSCC 标本中，与浸润性肿瘤相邻的增生不良上皮中也不雅察到与肿瘤细胞卓著的长荧光寿命值。g，h）舌 SCC 标本中肿瘤（红色）和泛泛组织（绿色）内的荧光强度（g）和 荧光寿命（h）直方图露出。i，j）每个患者（n = 7）的肿瘤（红色）和泛泛组织（绿色）的平均荧光强度（i）和 荧光寿命（j）露出为组织学淘气的肿瘤和泛泛组织的多个 ROI（大于 40）的平均值。k，l） Violin 图露出多个患者（n = 7）HN 肿瘤和泛泛组织类型中荧光强度（k）和 荧光寿命（l）的分散。NE，泛泛上皮；NS，泛泛基质；DS，脱鳞基质；SG，唾液腺。m）OSCC 肿瘤和泛泛口腔肌肉组织的代表性 TD 衰减弧线。n）统统征询患者（n = 7）的聪惠度与假阳性率（1 - 特异性）的 ROC 图。

Bone and soft tissue cancers

骨和软组织癌症

针对骨和软组织癌症的征询，作家选拔了包括原发性赘瘤和调整性结肠、乳腺以及肾癌等临床样本。闭幕标明，尽管在荧光强度图像（图 3b、g、l）中不错看到出血区、纤维组织和肌肉中存在较高的非特异性 ICG 经受，然而在荧光寿命图像中不错看到原发性赘瘤以及肾癌和乳腺癌的骨调整荧光寿命齐有明显的增强，尽管在荧光强度图像中存在非特异性 ICG 经受。意旨的是，别称子宫肌瘤患者，即使在术前麻醉拓荒时打针 ICG，也能不雅察到卓著大的肿瘤与泛泛荧光寿命对比。

按患者进行的分析露出，不同患者的平均荧光强度各异很大，其中三名患者泛泛组织的荧光强度高于肿瘤。关联词，统统患者的平均肿瘤荧光寿命齐明显长于泛泛组织 荧光寿命。ROC 分析露出，基于荧光寿命的肿瘤与泛泛分类的准确率、聪惠度和特异性高于基于强度的分类。关于领受新辅助放疗或化疗的赘瘤患者，肿瘤范畴表里出现不均匀的 ICG 经受，导致肿瘤与泛泛强度对比度较低。然而在统统领受调整的患者标本中，存活肿瘤区域内荧光寿命一致长于泛泛组织。

图3. a-e）别称打针了 ICG的患者的子宫肌层赘瘤标本中的荧光寿命图。f-j）骨赘瘤中的荧光寿命图。k-o）肾调整至骨的荧光寿命图。p，q）肿瘤（红色）和泛泛组织（绿色）的患者（n = 8）平均荧光强度（p）和 荧光寿命（q）r，s） Violin 图，露出多名患者（n = 10）赘瘤癌细胞和几种泛泛组织类型的荧光强度（r）和 荧光寿命（s）的分散情况。BV，血管；CT，结缔组织；AT，脂肪组织。t）十名患者标本数据中肿瘤与泛泛分类聪惠度与 1 - 特异性的 ROC 图。

Brain tumours肿瘤

脑肿瘤胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度浸润性的肿瘤。在领受GBM手术的患者中，输注5毫克/千克的ICG后，福尔马林固定的标本进行成像。与共聚焦组织学和荧光强度图像比较，荧光寿命图像露出肿瘤细胞和出血区域的ICG荧光强度较高，且只消在肿瘤区域不雅察到明显较长的荧光寿命。比较于其他赘瘤或头颈癌，GBM中的坏死瘤核显裸露更高的ICG保留率和较长的荧光寿命。

针对GBM标本，通过评分响应肿瘤细胞密度，将得到的ROI分红无、低、中、高四个组织学组。各组的ICG荧光强度卓著，但荧光寿命从低密度ROI到高密度ROI冉冉加多，导致平均荧光寿命与肿瘤密度呈很强的正联系。

患者间ROC分析，将无肿瘤和低密度ROI组互助为阴性组，将中度和高密度ROI组互助为阳性组。ROC弧线闭幕露出，基于荧光寿命的分类准确率为97.5%，聪惠度为90.7%，特异性为96.2%（J = 84.3%）；而基于荧光强度的分类准确率为33%，聪惠度为53%，特异性为20%（J = 26.9%）。

总的来说，对领受ICG打针的GBM标本进行荧光寿命测量，或者准确诀别中高密度区与低密度区（或无肿瘤区），可用于在GBM手术中细目肿瘤的浸润范畴。

图4. a、b）两名患者的高档别 GBM 10 µm FFPE 组织切片的组织学（左）、荧光强度（中）和 FLIM（右）。c-f）四个组织学类别的代表性组织学图像（上排）、荧光强度图像（中排）和荧光寿命图像（下排），即无肿瘤（c）、低密度（d）、中等密度（e）和高密度（f）。i） 使用 荧光寿命（红色）和强度（绿色）的聪惠度与 1 - 特异性的 ROC 弧线。

Detecting metastatic LNs

检测调整性淋攀附

除了对原发性肿瘤进行准确的边际检测外，在手术历程中对肿瘤阳性 LN 和阴性 LN 进行灵验诀别也十分进击。作家通过对领受颈部根治性切除术的患者进行荧光寿命成像，发现其中一个LN的ICG 荧光寿命较长，经组织学阐明为恶性；而荧光寿命较短的LN则经组织学阐明为良性。共聚焦FLIM图像进一步证实了成像闭幕，露出荧光寿命较长的LN含有调整性肿瘤结节，而荧光寿命较短的LN莫得肿瘤浸润的迹象。此外，在别称行肝部分切除术的调整性结肠癌（mCRC）患者中，切除的区域LN也显裸露访佛的荧光寿命增强，与组织学证实的调整性肿瘤结节相符。总的来说，作家对13个LN进行了评估，除了一个未露出ICG经受的阳性LN外，其余12个LN齐能通过FLIM准确识别。8个阳性LN在浸润肿瘤巢内显裸露长荧光寿命。而统统阴性的泛泛淋攀附露出了来自血管的高ICG荧光强度，且其荧光寿命相对较短。

图5. a）别称口腔 SCC 患者在颈部根治性切除术中切除的 LN 标本像片。b）统统这个词标本的广域荧光寿命图像露出.0。c-h）所示为肿瘤阳性 LN 组织切片的组织学（c，d）、荧光强度（e，f）和 FLIM（g，h）图像。i-n）肿瘤阴性 LN 组织切片的组织学（i，j）、荧光强度（k，l）和 FLIM（m，n）图像露出血管中 ICG 强度高但荧光寿命短（i，k 和 m 中的箭头）。j、l 、n ）分别是 i、k 和 m 中所勾勒的 ROI 的放大图。r-t）p 和 q 中矩形区域 "1 "的组织学（r）、荧光强度（s）和 FLIM（t）露出。u-w）p 和 q 中 "2 "区域的组织学和 FLIM（肿瘤范畴外）显裸露与 "1 "区域卓著的强度（v），但 荧光寿命（w）较短，与组织学（u）中 "2 "区域莫得肿瘤细胞相对应。x-z）兼并患者另一个淋攀附切片的 FLIM（未露出广域荧光寿命图像），露出调整癌细胞巢（x，箭头），强度高（y，箭头），荧光寿命 长（z，箭头），周围是泛泛淋巴组织，荧光寿命短。

 机制

Mechanism

为了细目ICG在癌细胞中FL增强的因素，作家对多个东谈主类癌细胞系（HepG2、U2OS、HT29和MDA-MB-231）进行了考据，闭幕标明，尽管ICG的经受和荧光强度险些疏通，然而肿瘤细胞中ICG的荧光寿命比泛泛细胞系（MCF 10A）长。此外，ICG在插足癌细胞后会在溶酶体内富集，而肿瘤细胞内偏酸性的环境可能是荧光寿命增强的拓荒因素之一，然而这一猜思在进一步的pH实验中被含糊。另外，ICG的荧光寿命会跟着溶剂粘度的加多而编削，而癌细胞内的较高细胞粘度可能会在影响ICG的荧光寿命。除了组织环境参数外，ICG与血清卵白齐集也会加多其的荧光量子产率。在实验要求下，ICG的荧光量子产率与浓度关系不大，但跟着浓度升高，荧光强度加多。此外，当有胎牛血清时，ICG的荧光强度和寿命齐会加多，这是因为ICG与白卵白齐集后环境的特色发生了变化。成像实考据实了血清卵白齐集对肿瘤细胞内ICG荧光特色的影响，标明了在肿瘤细胞中不雅察到的荧光寿命增强可能是ICG与血清卵白齐集和肿瘤细胞联系于泛泛细胞具有较高细胞内粘度的概括闭幕。

图6. a）在无血清（FBS）培养基中滋长的 HepG2 和 MCF 10A 细胞的代表性荧光强度和荧光寿命图像。b）在无血清培养基中，癌细胞 HT29（红色）和泛泛细胞 MCF 10A （绿色）细胞质中的代表性荧光衰减弧线。c）各式癌细胞（U2OS，红色；HT29，淡蓝色；HepG2，黄色；MDA MB 231，蓝色）胞质中荧光寿命分散直方图与 MCF 10A 中荧光寿命分散（绿色）的比较。d）U2OS 赘瘤细胞荧皎白微镜不雅察，露出 ICG 与细胞孵育 1 小时后定位于溶酶体中。蓝色：核染色（DAPI）；绿色：溶酶体染色（LysoTracker Deep Red）；红色：ICG；黄色：共定位：e）凭证多个像素点上 LysoTracker 和 ICG 荧光强度的联系性（R = 0.87）测量 ICG 与溶酶体的共定位分析。f）ICG荧光寿命与溶剂粘度的关系。h-l） ICG荧光寿命与血清卵白齐集的关系。

Discussion

论断

这篇征询说明使用ICG动作通用成像象征物对多种实体瘤进行成像是具有临床应用长进的。临床数据露出，从皮肤、口腔、肝脏、结直肠、骨骼等多种实体瘤中ICG的荧光寿命明显长于泛泛组织。共聚焦FLIM手艺不错高分辨率地分析单个肿瘤细胞，对良性和恶性淋攀附以及大型切除标本中的肿瘤和泛泛组织进行分类，准确率朝上97%。

征询还发现，除了肿瘤外，某些非肿瘤组织也可能呈现出与肿瘤荧光寿命卓著的增强。这是因为一些要素，如TILs和纤维瘤囊，露出了与肿瘤访佛的荧光寿命对比度。此外，征询揭示了ICG在癌细胞里面的内化机制，并与溶酶体共定位。荧光寿命的变化与粘度密切联系，癌细胞内溶酶体的高粘度可能导致ICG的荧光寿命增强。

终末，征询建议了在临床履行中运用荧光寿命成像的长进。通过设定安妥的荧光寿命阈值，不错快速、准确地细目手术切除边际，同期对大型标本进行自动化概括病理评估制服丝袜，为临床调整提供了新的可能性。近红外荧光寿命成像在癌症调整中的世俗应用长进也被强调，涵盖了会诊、术中指引和术后组织病理学等多个方面。